快速理解mRNA疫苗關鍵技術
及
已在本地實現的製程
(Overview of mRNA vaccine technology and what has been implemented in Taiwan)
mRNA疫苗是將目標抗原的基因序列以基因工程的方式，將其DNA序列構築至適合的DNA質體(plasmid)或載體(vector)，再以分子生物技術將DNA vector中的對應的RNA序列轉錄(transcription)為RNA，唯工廠生產RNA並不是透過生物體，而是以體外合成的方式，體外合成需先做出RNA，再進一步修改為mRNA，修改時需加上帽端(cap)及長片段A (poly-A)，各家製成mRNA方式略微不同，但整個mRNA的標準結構由5’端至 3’端依序為帽端子(cap)–5’端非轉譯區(5’UTR)、目標蛋白轉譯區(ORF)、3’端非轉譯區(3’UTR)及聚合體(A)尾(poly(A)tail)，生產的RNA再以適合的傳送技術送至人體細胞，再由細胞依據送mRNA轉譯出對應的目標抗原蛋白，與一般直接將蛋白打入人體以產生抗體的疫苗技術與原理不同，此mRNA技術的優點為在設計和構建上具有快速性、應變性以及可以簡單的以全合成設計序列等優勢，適合突變快速的病毒，如新型冠狀病毒在全球範圍爆發和蔓延後，隨著病毒的變化可快速生產相應的mRNA疫苗。因為Pfizer/BNT及Moderna的mRNA疫苗在臨床上的安全性和保護效力得到優異的成效後，使得mRNA疫苗技術得到廣泛關注並推動了其快速發展。相比於其他類型的疫苗，mRNA疫苗藥學研發、保存、運送及在人體的傳送系統的建立至關重大，mRNA疫苗開發的關鍵技術流程如下：
鴻林堂生物科技目前在mRNA疫苗生產的相關技術能力
鴻林堂生物科技已經在台灣累積多年mRNA前端相關技術之開發經驗，後端技術近期亦有相關成果與規劃如下。目前以綠色螢光蛋白為模式，製成mRNA脂質納米顆粒（LNP）後，再以細胞試驗，明顯觀察到綠色螢光蛋白的表現，詳下圖。足見本公司在mRNA製造工藝已有一定技術能力與水準，於新冠肆虐2年來，希望能透過本公司的技術，為台灣及世界在mRNA疫苗供獻一份心力。
鴻林堂生物科技公司在mRNA 疫苗製造中已完成開發及開發中的相關技術
1
．
DNA plasmid 生產部分
1.1 DNA
點突變技術(point mutation)可快速應變病毒的序列變化進行突變設計與生產
1.2 plasmid DNA
量產技術, 其中包括
(1)
內毒素移除技術(endotoxin remove)
(2) RNA
移除技術( RNA remove)
(3) gDNA
移除技術(genomic DNA remove)
(1) 內毒素移除技術(endotoxin remove)
(2) RNA 移除技術( RNA remove)
(3) gDNA 移除技術(genomic DNA remove)
1.3 目前已建立DNA 模板系統
(1) Pfizer/BNT 棘蛋白(spike protein)的全長序列 ( 含Delta, C2, Mu 病毒株的衍生序列)
(2) Modenra 棘蛋白(spike protein)的全長序列
(3) SMOBiO自行設計棘蛋白(spike protein)的全長序列及較長poly (A) tail(200~300 A tail)設計
(4) 綠色螢光蛋白(GFP) 序列
1.4 已建立 DNA模板系統圖示(依各家提供的序列設計並構築，其中Moderna以其提供的CDS部分 進行 設計。
2．
mRNA 生成
2.1 In vitro transcription系統:
(1) T7 RNA polymerase
T7 RNA聚合酶純化電泳圖， whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、Elute(純化)。
(2) RNase inhibitor (RNA酶抑制物)
RNA酶抑制物純化電泳圖， whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。
(3)核苷酸單體材料:
NTP: ATP、UTP、CTP、GTP、ψTP、N-methyl ψTP 無磷酸形式：A、U、 C、G、ψ、N-methyl ψ 之鹼基五碳醣。
由Uracil生產製造ψTP 過程中HPLC監控
由ψ0P (無磷酸) 至N1mψ0P生產製造過程中HPLC監控
ψ的Mass, NMR結果如下:
ψ的 H NMR:
Pseudouridine 碳譜NMR (13C NMR):
(4) 痘病毒加帽端酶 (Vaccinia caping enzymes)含D1, D12
D1, D12酶純化電泳圖， whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。 D1蛋白仍待進一步調整純化中。
(5)2′O-甲基轉移酶 (2′O -methyltransferase)
2’-O methyltransferase 酶純化電泳圖， whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。
(6)無機焦磷酸酶 (Inorganic Pyrophosphatase)
Inorganic Pyrophosphatase 無機焦磷酸酶純化電泳圖， whole(全部菌裂解液、Sup(上清液)、pellet(不溶沈澱物)、 Ft (未結合流出液)、 W(清洗液)、 Elute(純化)。
2.2 RNA (mRNA)提純技術:oligo-dT resin(磁珠)技術開發中
3．
mRNA奈米顆粒脂質包裏技術 (mRNA LNP)
(1) 關鍵陽離子脂質量產合成技術
ALC 0315陽離子脂質量產
ALC-0315 Mass
ALC-0315氫譜 NMR
ALC-0315 碳譜NMR
鴻林堂生物科技合成 ALC0315的(A)原液 及( B)溶於乙醇的狀態
(2)mRNA LNP微流控混合技術
